천년초 추출물이 조골세포의 증식과 ROS(활성산소) 소거능에 미치는 영향

황현정1․ 정복미2 ․ 김미향1 *(1신라대학교 식품영양학과, 2전남대학교 식품영양학과)

우리나라에서 자생하고 있는 천년초는 새로운 생리활성 물질을 생산할 수 있는 소재로 각광받고 있으며, mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 세포는 골세포의 세포 활성과 관련된 연구에서 유용하게 이용되어 왔다.

따라서 본 연구에서는 MC3T3-E1 세포를 이용하여 천년초 추출물이 세포 증식에 미치는 영향과 ALP 활성, 조골세포의 골 형성을 위한 필수 인자인 collagen 합성에 대한 영향을 검토하고 세포사의 주요 인자인 ROS(활성산소)에 미치는 영향에 대해 검토하였다.

각 추출물의 수율은 껍질 열수 추출물이 35.2%로 가장 수율이 높았고, 다음으로 줄기열수 추출물, 껍질 에탄올 추출물, 씨 열수 추출물, 줄기 에탄올 추출물 순으로 나타났으며, 수율이 가장 낮은 씨 에탄올 추출물은 20.6%였다.

각 추출물의 농도(1, 10 50, 100 μg/ml)에 따른 조골세포 성장에 미치는 영향을 MTT assay로 분석한 결과, 모든 군에서 대조군과 비교하여 유의적인 증식률을 나타내었으며 특히, 100 μg/ml 씨 열수 추출물을 첨가하였을 때, 대조군과 비교하여 가장 높은 120% 정도의 증식률을 나타내었다.

천년초 추출물이 ALP 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 천년초 추출물을 10~50 μg/ml 첨가하였을 때, 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였으며 특히, 씨 에탄올 추출물을 50 μg/ml 첨가하였을 때, 130% 이상의 ALP 활성을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성이 제시 되었다.

{천년초 추출물이 조골세포의 collagen 합성에 미치는 영향 결과}

천년초 추출물이 조골세포의 collagen 합성에 미치는 실험결과에서는 천년초 씨 열수 추출물과 씨 에탄올 추출물의 50~100 μg/ml 농도에서 높은 합성능을 나타내었으며 그 중 씨 열수 추출물 100 μg/ml 농도에서 가장 높은 collagen 합성능을 보였다.

천년초 추출물이 세포내 ROS 생성에 미치는 영향을 실험한 결과에서는 모든 천년초 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 형광 강도가 감소하는 경향을 보였으며 특히, 씨 열수 추출물의 100 μg/ml 경우, 대조군에 비해 54% 정도 ROS가 감소되어 천년초씨 추출물이 세포 내에서 높은 항산화력이 있는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 천년초 추출물이 조골세포의 증식, ALP 활성, collagen 합성 및 ROS 생성 저해를 촉진하여 골 생성에 영향을 줄 수 있는 것이 확인되었으며, 추출 용매와 관계없이 씨 추출물이 가장 높은 활성을 나타내었다. 천년초 씨 중의 활성 성분 구명을 위해 향후 구체적 기작 연구와 in vivo 연구가 병행된다면, 골다공증 예방과 관련된 기능성 식품의 천연소재 개발이 가능할 것이라 사료된다.

<서 론>

인간의 인생 주기 중 중년기는 신체 기관의 기능 감퇴, 노화, 호르몬 변화로 여러 가지 건강 문제를 경험하게 되는데, 특히 골다공증은 여성의 폐경과 관련된 에스트로겐 호르몬 결핍으로 발생하는 질환으로 알려져 있다.

2010년 발표한 건강보험심사청구데이터에 의하면 연간 인구대비 골다공증의 의사진단 환자비율은 매년 8.7%씩 증가하고 있으며, 2005년부터 2008년까지 50세 이상의 골다공증성 골절의 발생은 연평균 3.8%씩 발생수가 증가하는 양상이 나타났다.

대표적인 골 대사 질환인 골다공증은 효과적인 치료 방법이 없기 때문에 예방이 가장 중요하며, 현재까지 알려진 최선의 치료는 성장기 동안의 최대 골 질량(peak bone mass)을 극대화하고 골 손실 위험 인자를 피하는 것이라고 한다.

현재 골다공증의 예방과 치료에 가장 많이 이용되고 있는 방법은 비타민 D의 보충과 함께 에스트로겐, 칼시토닌, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 및 비스포스포네이트 등의 처방이 알려져 있다.

{조골세포}

조골세포는 골조직의 세포 외 기질을 합성하고, 기질의 침착과 석회화를 조절하는 골격계의 주된 세포이며[29], 연골세포(contracts), 간엽줄기 분화세포(myocytes) 및 지방세포(adipocytes)로 분화가 가능한 골 기질 합성과 석회화에 관여하는 세포이다.

세포막에는 당단백 효소인 alkaline phosphatase(ALP)가 존재하고 있으며, 이는 기질 특이성과 염기성 pH에서 최적의 활성을 나타내고 세포의 외막과 석회화 조직의 기질 소포에서 높은 농도로 존재한다.

Collagen은 경 섬유 단백질로써, 결합조직에 광범위하게 분포되어 있으며[23], 여러 cytokine의 분비를 통해 파골세포의 활성을 조절하는 기능을 담당하고 있다. 이들 cytokine은 골세포 자체로부터 합성되어 골 기질 내로 함입되고, 생물학적으로 활성화된 형태로 유리된다고 알려지고 있다.

또한 활성화된 조골세포는 골 기질을 형성하는데 collagen, osteocalcin, osteopontin 및 bone sialoprotein과 같은 물질을 합성하여 석회화 과정에 중요한 역할을 한다.

골세포의 배양법은 골의 대사, 골세포의 생성 및 분화 등의 연구와 골 대사에 미치는 효과, 식품유래 천연물질의 골 대사 조절물질을 검색하는데 비교적 간편하면서 유용한 방법으로 알려져 있다.

본 연구에 사용한 mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 세포는 in vivo 골 형성 과정에서 나타나는 세포의 증식, 분화, 석회화 등 골아세포와 유사한 대사적 특징을 가지고 있으므로, 골세포의 세포 활성과 관련된 연구에서 유용하게 이용되어 왔다.

최근 질병 치료, 예방 및 건강증진 등 생리활성을 가지는 기능성 물질은 식품․의약품 시장에서 높은 성장가능성을 갖는 산업분야로 떠오르고 있으며, 특히 천연물 유래 물질은 화학 합성품에 비해 각종 질병에 효과적인 경우가 많고 낮은 독성과 부작용에 대한 인식으로 높은 소비자 선호도를 보이고 있다.

본 연구에 사용된 천년초 선인장(일명 손바닥 선인장)은 우리나라에서 자생하는 ‘Opuntia'속 선인장으로 충남 천안, 아산지역에서 모종이 퍼져나간 것으로 알려져 있으며 현재 재배되는 지역으로는 경기도, 전라도, 충북, 경상도, 제주도 등지에서 생존하는 다년생 현화식물이다. 제주도 선인장은 ‘Opuntia'속 선인장이나 월동이 불가능한 것으로 확인된다(일명 백년초).

천년초 선인장은 줄기의 길이가 30∼40 cm, 영하 20℃의 혹한에서도 자체수분을 절반이하로 감소시켜 얼어 죽지 않고 생명력을 유지하는 특성을 갖고 있어 지역특화산업을 위한 신 작물로의 개발이 유망 시 되고 있다. 예로부터 본초강목과 중앙대사전에 의하면, 선인장 즙을 마시면 변비치료, 이뇨효과, 장 운동의 활성화 및 식욕증진 효능이 있고, 피부질환 및 화상치료에도 사용되어 왔다고 한다.

하지만 이러한 효능에도 불구하고 아직 천년초에 대한 연구는 열매와 줄기를 이용한 일반성분 분석과 무기질함량에 대한 분석 등 구성성분에 관한 연구가 대부분이다. 또한 생리활성에 관한 연구로는 천년초 줄기를 이용한 항산화 및 항비만 활성검증 및 사염화탄소를 처치한 흰쥐에서의 간 보호 효과 등이 이루어졌으며, 천년초가 골 대사에 미치는 영향에 관한 연구는 전무한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 MC3T3-E1 세포를 이용하여 천년초 추출물이 조골세포의 증식에 미치는 영향, 조골세포의 활성과 분화 인자인 ALP 활성, 골 형성을 위한 필수 인자인 collagen합성에 미치는 영향 및 조골세포 세포사의 주요 인자인 ROS에 미치는 영향에 대해 검토하였다.

천년초 열수 또는 에탄올 추출물 10 μg/ml 이상 첨가한 모든 군에서 대조군과 비교하여 유의적인 증식률을 나타내었다. 특히, 100 μg/ml 씨 열수 추출물을 첨가하였을 때, 대조군과 비교하여 가장 높은 120% 정도의 증식률을 나타내었다. 조골세포 증식과 관련한 천연 식물의 연구에서 전에 의하면 해조류인 톳 분획물의 경우 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였고, 특히 butanol 분획물에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 본 연구에서는 천년초 추출물을 사용하였으나, 톳 분획물과 거의 유사한 활성을 나타내어 골 형성 소재로써 활용 가능성이 충분히 있음을 확인하였다.

{Alkaline phosphatase (ALP) 활성에 미치는 영향}

염기성 인산분해 효소(Alkaline phosphatase; ALP)는 거의 모든 조직에 존재하며 특히 골조직에 존재하는 ALP는 골 성장이 활발히 일어날 때 그 활성이 증가한다. 따라서 조골세포 활성을 나타내는 biomaker로써[10], MC3T3-E1 조골세포에서의 ALP 활성을 측정하여 천년초 추출물이 조골세포의 골 성장 활성에 미치는 영향을 검토하였다.

조골세포의 ALP 활성은 천년초 추출물을 10~50 μg/ml 첨가하였을 때, 열수 및 에탄올 추출물 모두 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였다(Fig. 2). 특히, 씨 에탄올 추출물을 50 μg/ml 첨가하였을 때, 130% 이상의 활성을 나타내었다. 주로 세포막에 결합되어 존재하는 염기성 인산 분해효소는 기질 특이성과 염기성 pH에서 최적의 활성을 나타내는 효소로써 골세포 분화의 표지인자로 알려져 있다.

따라서 씨 에탄올 추출물이 조골세포의 ALP의 발현을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성을 제시하고 있다. 조골세포 배양 시 첨가한 vitamin C와 β-glycerol phosphate는 ALP와 세포 외 기질의 석회화에 영향을 미친다고 알려져 있으며 vitamin C는 MC3T3-E1 세포에서 type Ⅰ collagen 발현을 자극하지는 않지만 세포외 기질에서 collagen 침착에는 반드시 필요하며, 성숙세포에서 ALP의 활성을 유도한다. β-glycerol phosphate는 vitamin C에 대해 상승효과를 보이며, 분화된 조골세포에서 collagen 축적이나 ALP 활성도를 더욱 증가시킨다고 보고되고 있다.

천년초의 성분을 분석한 결과 flavonoid 계열 중 flavanone 계통의 taxifolin [19] 등과 다량의 vitamin C가 함유되어 있다[39]는 보고가 있는데 이들 성분들이 조골세포의 분화에 영향을 미치는 것으로 보인다. 이상의 결과로 황금 추출물, 아보카도 과피 및 씨 추출물에서 조골세포의 ALP 활성을 증가시켰다는 보고와 유사하게 천년초 추출물에서도 ALP 활성을 가짐을 확인하였다. ALP는 조골세포의 분화에 발현되는 분화 표식인자이므로 이러한 결과는 조골세포의 ALP 발현을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성을 제시했다. 따라서 천년초 씨, 껍질 및 줄기 추출물은 조골세포 증식을 촉진 할 뿐만 아니라 ALP 활성을 높이는 소재로 생각 할 수 있다.

{조골세포의 collagen 합성에 미치는 영향}

골 형성이 이루어지는 과정은 type Ⅰ collagen의 합성과 세포내의 과정 그리고 세포 외로 분비, 섬유질의 형성 및 collagen 기질의 성숙과 hydroxyapatite 형성 등의 단계를 밟는다[37]. 조골세포에서 합성되는 type Ⅰ collagen은 전체 골 단백질의 85~90%를 차지하며, 조골세포는 여러 가지 호르몬 국소 인자에 의해 조절되고 있다.

대표적으로 부갑상선 호르몬, 갑상선 호르몬, 1,25(OH)2D3, 성호르몬, insulin 등이 있고 국소인자로는 프로스타글란딘과 여러 종류의 cytokine 이 이에 해당된다[4]. 뼈는 주로 collagen과 칼슘으로 구성되어 있으며, 계속 성장하며 살아있는 조직이다. Collagen은 뼈에서 부드러운 골격을 형성하는 단백질이고 인산칼슘이라는 미네랄이 뼈의 골격을 강하고 단단하게 만들어 준다.

또한 collagen은 골조직의 유기물의 대부분을 차지하며, collagen이 적절하게 생성되지 못하는 조건에서는 골조직의 석회화가 일어나지 않을 뿐만 아니라 ALP 활성 저하 및 osteocalcin 의 생성 또한 매우 감소하는 것으로 알려져 있다. Fig. 3에 천년초 추출물이 조골세포의 collagen 합성능에 미치는 영향을 나타내었다. 천년초 추출물을 10~100 μg/ml 첨가하였을 때, 대조군과 비교하여 유의적으로 증가된 collagen합성능을 보였다.

특히, 씨 열수 추출물과 씨 에탄올 추출물의 50~100 μg/ml 농도에서 높은 합성능을 나타내었으며 그 중 씨 열수 추출물 100 μg/ml가 collagen 합성에 가장 효율적인 영향을 미치는 것으로 나타났다.

ROS(Reactive oxygen species) 생성에 대한 영향 활성산소(ROS)는 산소의 환원 대사물로서 정상 세포 내 대사 과정이나 세포질 내 효소 작용에 의해 내부로부터 형성되거나 다양한 외부 요소에 의해 형성된다. 세포들은 ROS의 축적과 손상에 대항하기 위해 항산화 방어기전을 갖추고 있는데, ROS 발생이 세포의 항산화 능력을 초과하는 경우 산화적 스트레스에 노출된다.

또한 본 연구에 사용된 MC3T3-E1 세포에 H2O2를 첨가한 결과 조골세포의 분화를 저해하였다는 연구와 산화적 스트레스로 인한 조골세포의 저해는 항산화제의 첨가로 차단되었다는 연구도 보고되었다. 0.3 mM H2O2 투여 후의 조골세포 내의 ROS 생성 수준은 천년초 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 형광 강도가 감소하는 경향을 보였으며, 특히 씨 열수 추출물의 50 μg/ml 및 100 μg/ml 경우는 대조군에 비해 50% 정도 ROS가 생성된 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 4). 따라서 천년초 씨 추출물이 세포 내에서 높은 항산화력을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

활성산소(ROS)는 생체세포를 공격하여 DNA, RNA를 파괴하는 등 암을 발생시키고 노화를 촉진시키지만 한편으로는 병원체나 이물질을 제거하기 위한 생체 방어 과정에서 O2, H2O2와 같은 활성산소가 대량 발생하여 이들의 강한 살균작용을 통해 병원체로부터 인체를 보호하는 양면성을 가지므로 관관계에 따른 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.